L'efficacité en carbone est l'un des principaux facteurs définissant la viabilité d'un processus de voie métabolique et est le principal déterminant du taux de produit par unité de substrat. Deux facteurs déterminent l'efficacité carbone : le bilan électronique du substrat au produit, qui peut être calculé à partir du degré de réduction du substrat et du produit, et le fait que les voies métaboliques existantes sont principalement conçues pour des taux de réaction plus élevés plutôt que pour des rendements carbone élevés. Le premier facteur est étroitement lié à la composition chimique du substrat et du produit. Le second facteur peut être surmonté en modifiant la conception de la voie métabolique, ce qui permet de conserver le carbone du substrat ou, dans certains cas, de l'assimiler pendant la formation du produit.

1. L'équilibre redox dans levure métabolisme L'efficacité des voies métaboliques nécessaires à la production biologique efficace de substances chimiques dépend de divers facteurs tels que l'équilibre redox, l'équilibre énergétique, la faisabilité thermodynamique, l'équilibre stœchiométrique, le couplage des flux, l'inhibition par rétroaction, la toxicité des produits, la cinétique, etc. Le métabolisme cellulaire maintient la croissance cellulaire et l'équilibre redox en transférant les électrons des substrats aux différents métabolites. Par conséquent, la voie de biosynthèse optimale pour la production d'un métabolite souhaité doit être neutre sur le plan redox et le rendement de la voie (YP) doit être égal ou très proche du rendement théorique maximal (YE) de la combinaison substrat-produit cible.Le YP dépend de la voie impliquée et est déterminé sur la base de sa stœchiométrie, tandis que le YE est la quantité maximale de produit qui peut être formée à partir du substrat et peut être calculé à partir du rapport substrat/produit γS/γP calculé où γS et γP sont le degré de réduction du substrat et du produit, respectivement. Le degré de réduction peut être défini comme le nombre d'équivalents d'électrons disponibles par atome de carbone du composé. Par conséquent, l'EJ doit tenir compte du bilan électronique pour la conversion d'un substrat en un produit, ce qui peut nécessiter une décarboxylation entraînant une perte de carbone, ou une carboxylation pour fournir une absorption supplémentaire de carbone. La figure suivante illustre la voie métabolique centrale de la levure. Figure 1. Voie métabolique centrale du carbone de la levure, mettant en évidence la relation entre les étapes de carboxylation/décarboxylation et les changements dans le degré de réduction du substrat et du produit. Le degré de réduction des substrats, métabolites intermédiaires et produits correspondants est indiqué par le changement de couleur du rouge (γ=0) au jaune (γ=4) et au bleu (γ=6).
Selon le degré de réduction du substrat et du produit cible, on peut distinguer trois cas : lorsque le substrat et le produit cible ont le même degré de réduction, il existe une situation idéale dans laquelle le substrat est entièrement converti en produit. En d'autres termes, le rendement réel du produit peut être proche du rendement théorique maximal (YE), mais le processus métabolique produira des sous-produits pour la formation de la biomasse et le maintien de la croissance cellulaire, ce qui réduira le rendement du produit. Un exemple est l'acide lactique (γ = 4,0), qui a le même degré de réduction que le glucose (γ = 4,0). Par conséquent, le processus de production du lactate est une voie redox-neutre avec une stœchiométrie équilibrée, tout en permettant la génération d'ATP, ce qui se traduit par un taux proche du rendement théorique maximal. Globalement, pour d'autres substrats-produits, il est rare de trouver de telles voies qui ne génèrent pas un pouvoir réducteur excessif.
Lorsque le produit est plus réduit que le substrat, les réactions d'oxydation nécessaires à la formation du produit génèrent des équivalents oxydatifs supplémentaires (NAD+, NADP+, FADH+). Pour réduire ces équivalents oxydatifs, la cellule doit oxyder le carbone en CO2 et/ou en d'autres sous-produits (par exemple, dans la voie du pentose phosphate (PPP), le cycle TCA ou le cycle du phosphate de xylulose (XuMP)) afin de maintenir l'homéostasie redox. Ce processus peut affecter l'efficacité globale de la conversion des substrats en produits cibles. Les acides gras, l'éthanol et le glycérol en sont des exemples.
L'utilisation du glucose comme substrat pour générer des acides gras, tels que l'acide palmitique (γ = 5,75), réduit les rendements en acides gras en raison des besoins élevés en NADPH et de la libération de CO2 pendant l'extension de la chaîne carbonée, ce qui entraîne une perte de substrat.Yu et al [1] ont réussi à augmenter les rendements en acides gras chez Saccharomyces cerevisiae jusqu'à 40% en construisant une voie métabolique réductrice anabolique caractérisée par un cycle de décarboxylation répétitif pour fournir à la cellule du NADH, du NADPH et de l'ATP supplémentaires.
La production d'éthanol à partir de glucose oxyde également certains substrats en CO2 et en glycérol en raison de la nécessité de fournir du NADH. Cependant, la voie naturelle de la levure pour la fermentation de l'éthanol conserve le degré de réduction du glucose (γ = 4,0), avec une réduction moyenne globale de γ = 4,0 lorsque le CO2 et l'éthanol sont les produits finaux.Ainsi, la voie métabolique est très efficace du point de vue du rendement, convertissant seulement 4-5% de la source de carbone en glycérol. De même, lorsque le 1,2-propanediol (1,2-PDO) (γ=5,33) a été produit par la levure de bière en utilisant le glycérol (γ=4,66) comme seule source de carbone, la modification de l'ingénierie métabolique a fourni du NADH supplémentaire pour faciliter la synthèse du 1,2-PDO, atteignant les rendements les plus élevés à ce jour dans la levure de >4 g/L de 1,2-PDO.
Lorsque le produit est réduit en dessous du substrat, des équivalents réducteurs et du produit sont générés lors de la production du produit. Un mécanisme courant de réoxydation des équivalents réducteurs excédentaires est l'oxydation par la chaîne respiratoire, qui génère un excès d'ATP et/ou libère de la chaleur. En conséquence, le rendement du produit est inférieur au maximum théorique réalisable avec les électrons disponibles. Une autre solution consiste à consommer les équivalents réducteurs excédentaires en réduisant une partie de la source de carbone en sous-produits réducteurs. Cette combinaison substrat-produit a le potentiel de fixer le carbone pour augmenter le rendement du métabolite cible. Comme dans la production d'acide citrique (γ = 3,0) à partir du glucose, le débordement d'énergie dû à la formation de NADH signifie que la cellule peut simplement gagner de l'énergie en fabriquant le composé cible au prix d'une perte de rendement. La faible efficacité de la voie biochimique naturelle pour la synthèse de l'acide citrique représente donc une opportunité d'atteindre un taux de gain théorique proche du maximum qui peut être atteint en fixant le carbone.
Par conséquent, les substrats à utiliser dans le produit souhaité peuvent être sélectionnés sur la base des γS et γP afin de maximiser le rendement. Le substrat préféré de la levure, le glucose, peut être utilisé pour synthétiser des produits ayant le même γ que le glucose, tels que l'éthanol (plus le CO2) ou l'acide lactique. Bien que le glucose soit le substrat préféré, il est en concurrence directe avec la production de denrées alimentaires ou d'aliments pour animaux. Par conséquent, plusieurs sources de carbone moins chères telles que le glycérol, le méthanol et le CO2 sont considérées comme des substrats prometteurs.
Le méthanol (γ = 6,0) est une matière première C1 avec un haut degré de réduction. L'un des principaux avantages de l'utilisation du méthanol comme source de carbone est son pouvoir réducteur qui, dans les micro-organismes tels que la levure méthylotrophe, forme du NADH et génère de l'ATP. Cependant, étant donné que la première réaction de la voie est l'oxydation du méthanol en formaldéhyde en utilisant l'oxygène comme accepteur d'électrons, la levure perd un NADH pour chaque portion de méthanol absorbée.Des études récentes ont montré que Komagataella phaffii était capable d'utiliser le méthanol plus efficacement en surexprimant la méthanol déshydrogénase endogène (Adh2) dans une souche déficiente en alcool oxydase (Mut-), ce qui a entraîné la production de NADH et d'ATP supplémentaires pour chaque portion de méthanol, permettant ainsi à la souche Mut-Adh2 d'augmenter l'intensité de la production de protéines hétérologues dans des conditions de faible consommation d'oxygène et d'émission de chaleur.
Une autre source de carbone prometteuse est le CO2, qui est un composé hautement oxydé (γ=0) pouvant être réduit par les autotrophes pour produire des composés organiques pour la biosynthèse. Par conséquent, l'une des façons d'introduire le CO2 dans le métabolisme de la levure est la conversion du cosubstrat, qui convertit le CO2 avec une autre source de carbone en un produit dont le degré de réduction est inférieur à celui du cosubstrat. Dans la biosynthèse des acides organiques, qui ont un γ inférieur à celui du glucose, tels que les acides citrique, maléique et succinique, cette stratégie permet d'incorporer le CO2 dans les processus de fermentation industrielle afin d'augmenter le rendement en carbone.

2. Comment équilibrer le degré de réduction des produits ? L'évolution des processus métaboliques dans les micro-organismes est généralement basée sur la croissance rapide des cellules plutôt que sur la production de produits spécifiques. Par conséquent, la cellule privilégie un métabolisme rapide plutôt qu'un rendement élevé en carbone. Par conséquent, la capacité des cellules à améliorer la rétention du carbone pendant le métabolisme est l'un des plus grands défis de l'ingénierie métabolique, qui empêche les usines microbiennes de parvenir à une production chimique à haut rendement. Cet article traite de l'ingénierie métabolique de la levure visant à maximiser la rétention du carbone, y compris la fixation du CO2, et à éviter les étapes de décarboxylation non essentielles dans la cellule.2.1 Intégration du carbone inorganique dans le métabolisme cellulaire en utilisant le CO2 comme substrat Il existe différentes voies : une molécule de CO2 forme des composés organiques par carboxylation ; le CO2 est converti par réduction en acide formique ou en CO, qui peut être assimilé dans la biomasse. Les réactions de carboxylation sont catalysées par des carboxylases, telles que RuBisCO dans le cycle CBB de la voie autotrophe de fixation du CO2 ou les enzymes Pck et Pyc, qui interviennent dans la fourniture de précurseurs métaboliques centraux. Le principe de la réduction du carbone est que le CO2 est réduit en acide formique ou en CO par la formate déshydrogénase ou la CO déshydrogénase, comme dans la voie de l'acétyl-coenzyme A réduit.2.1.1 Expression d'enzymes CBBase hétérologues pour la fixation du CO2 dans la levureProduction d'éthanol dans S. cerevisiae Dans la production d'éthanol dans S. cerevisiae, Guadalupe-Medina et al [2] ont utilisé le CO2 comme accepteur d'électrons pour exploiter l'excès de pouvoir réducteur, c'est-à-dire la conversion du CO2 en PPP, la conversion du CO2 en Ru5P, métabolite intermédiaire de la voie PPP, par les enzymes RuBisCO et Prk de la voie du cycle CBB, ce qui a entraîné une augmentation de 10% de la production d'éthanol et une diminution de 90% de la production de glycérol en tant que sous-produit.Xia et al [3 ] ont constaté un déséquilibre redox au cours de la fermentation anaérobie lorsque le xylose a été utilisé comme substrat pour la production d'éthanol. L'expression de RrRuBisCO et SoPRK a permis la réutilisation du CO2 provenant de la décarboxylation du pyruvate et a réduit le rendement des sous-produits xylitol et glycérol.Gassler et al[4] ont construit un cycle CBB fonctionnel dans la levure méthylotrophe K. phaffii, qui fournit de l'énergie et du pouvoir réducteur via le méthanol et produit de l'acide lactique et du malonate en utilisant le CO2 comme source de carbone.2.1.2 Voie de la glycine réductrice
La voie de la glycine réductrice est considérée comme la voie la plus efficace pour la croissance aérobie utilisant l'acide formique. Toutes les enzymes de la voie de la pro-glycine sont présentes dans S. cerevisiae, mais elle ne peut pas utiliser l'acide formique comme substrat pour la croissance. La surexpression des enzymes endogènes de la voie a entraîné l'expression fonctionnelle de la voie réduite de la glycine, qui permet la synthèse de la glycine à partir de l'acide formique et du CO2 comme co-substrat pour soutenir la croissance des souches déficientes en glycine. Cette voie dépend de fortes concentrations de CO2 (10%). Récemment, une voie de la glycine réduite naturellement résistante à l'oxygène a été identifiée chez K. phaffii, mais l'activité naturelle de cette voie n'est pas suffisante pour soutenir la croissance cellulaire.
2.1.3 Branche réduite du cycle TCA (rTCA)
Le cycle TCA réduit (rTCA) est une voie de fixation du CO2 que l'on trouve chez les procaryotes. Le rTCA est le processus inverse du cycle TCA oxydé et forme une molécule d'acétyl-coenzyme A en fixant deux molécules de CO2. Jusqu'à présent, le cycle inverse complet du TCA n'a pas été réalisé chez la levure. Un rTCA partiel a été réalisé chez Saccharomyces cerevisiae pour produire de l'acide succinique et de l'acide malique. Yan et al [5] ont surexprimé les gènes codant pour les trois premières enzymes du cycle Pyc2 et rTCA, Mdh3R, EcFumC et FrdS1, dans des souches déficientes en Pdc et Fum1, ce qui a permis d'obtenir un rendement d'acide succinique allant jusqu'à 13 g/L, avec un rendement de 0,21 mol/mol.21 mol/mol. Malubhoy et al [ 5] ont synthétisé 35 g/L d'acide butanedioïque avec un rendement de 0,63 mol/mol de glycérol via la voie du cycle rTCA, tandis que le processus a également réalisé une fixation nette de CO2.
2.2 Éviter une décarboxylation inutile
La décarboxylation biologique se produit principalement dans les voies cataboliques telles que la glycolyse, la PPP et le cycle TCA, où la réaction libère du CO2 et est souvent associée à une oxydation pour régénérer le NADH et le NADPH. La décarboxylation se produit également dans les voies des métabolites précurseurs des produits finaux, où les réactions de décarboxylation dans la voie réduisent toutes le rendement en carbone du substrat au produit. Par exemple, l'acétyl coenzyme A, un métabolite produit par la réaction de décarboxylation du pyruvate, entraîne une perte de carbone 33% sous forme de CO2, ce qui réduit le rendement théorique de tout processus impliquant l'acétyl coenzyme A en tant que précurseur. Il s'agit notamment du cycle TCA, de la biosynthèse des acides gras et des acides aminés. Hellgren et al [6] ont construit une voie cyclique de conservation du carbone (GATHCYC) basée sur la voie de la glycolyse non oxydative (NOG), qui génère trois molécules d'acétyl coenzyme A à partir d'une molécule de fructose 6-phosphate (F6P), et la voie ne perd pas de carbone. L'utilisation de cette voie a entraîné une augmentation de 109% de la production d'acide 3-hydroxypropionique. L'introduction de la voie GATHCYC dans une souche productrice de n-butanol a permis d'augmenter la production de n-butanol à 1,75 g/L et de réduire les émissions de CO2 de 35,2%.

3. Exemple de production d'acide succinique
Outre l'équilibre redox et la rétention de carbone, la faisabilité thermodynamique et l'équilibre énergétique sont des facteurs clés dans la conception de voies métaboliques optimales. La faisabilité thermodynamique fait référence au changement d'énergie libre de Gibbs (ΔrG'm) dans des conditions standard physiologiquement pertinentes et détermine si une voie métabolique est réalisable ou non. L'énergie cellulaire doit également être équilibrée pour produire davantage du composé cible, car les produits exigeant de l'énergie entraînent une perte de carbone du substrat pour répondre à la demande d'énergie, tandis que les produits oxydés entraînent un excès d'énergie et éventuellement une dissipation de chaleur. L'acide succinique (AS) est un métabolite intermédiaire du cycle TCA. La stœchiométrie de l'ATP, l'équilibre redox, la fixation du CO2, la faisabilité thermodynamique et la conservation du carbone sont évalués pour différentes voies de synthèse de l'acide succinique naturelles et artificielles. Il existe trois voies de synthèse de l'acide succinique : le cycle oxydatif du TCA (oTCA), le cycle réduit du TCA (rTCA) et la voie du glyoxalate (GS). Le cycle oTCA a un rendement maximal théorique plus faible, mais la production d'acide succinique dans des conditions aérobies présente l'avantage de produire peu de sous-produits et d'avoir des attributs métaboliques thermodynamiques plus favorables. Le gS est une méthode alternative pour la production d'acide succinique qui contourne les deux étapes de décarboxylation entre l'acide isocitrique et le butyryl coenzyme A pour éviter la perte de carbone et fournir du NADH supplémentaire. Le rTCA fixe le CO2 et est deux fois plus efficace que la voie de l'oTCA. Il est important de noter que le taux de rendement (YP) est un paramètre local qui ne prend en compte que la stœchiométrie nette dans la voie et ne tient pas compte de la perte de carbone pendant la régénération du NAD(P)H ou la génération d'ATP. Cependant, le rendement théorique maximal (YE) est un paramètre global qui tient compte de l'équilibre des électrons et donc également de la régénération du NAD(P)H. Par conséquent, dans certains cas, le YP peut être plus élevé que le YE. La synthèse de l'AS dans le cycle rTCA est principalement réalisée par les bactéries du rumen dans des conditions anaérobies. En revanche, pour la levure, le cycle rTCA est thermodynamiquement défavorable et entraîne un apport insuffisant de NADH cellulaire. La figure suivante compare la variation de l'énergie libre de Gibbs de la synthèse de l'AS via le cycle oTCA ou le cycle rTCA avec différentes sources de carbone. Il s'agit du glucose, du glycérol, du xylose via le cycle CBB partiel, de l'assimilation de l'acide formique ou du méthanol via la voie de la glycine réduite et de l'assimilation du méthanol via la voie du phosphate de xyloglucane. Figure 2. Production d'acide succinique par la branche oxydative ou réductrice du cycle TCA
La capacité de la levure à tolérer un pH plus faible et donc à réduire le coût de la production de SA au cours du traitement en aval a conduit à ce que la production de SA par la levure fasse l'objet d'une grande attention, en particulier le cycle rTCA qui est capable de fixer le CO2. Bien que la synthèse de l'AS à partir du glucose via la glycolyse et la voie du cycle rTCA puisse fixer 1 mol de CO2/mol d'AS, la voie n'est pas équilibrée sur le plan redox et nécessite 1 mol de NADH supplémentaire pour chaque mol d'AS produite. Une alternative intéressante consiste à utiliser le glycérol comme source de carbone, qui peut fixer 1 mol de CO2/mol d'AS via la voie rTCA, ce qui permet une production d'AS équilibrée sur le plan de la réduction oxydative. La réduction totale γ = 3,5 pour la combinaison glycérol + CO2 est la même que celle de l'AS. Malubhoy et al [5] ont obtenu un rendement de 0,6 g/g de glycérol en fixant du CO2, soit 47,1% du maximum théorique.
Une autre façon d'atteindre l'équilibre redox est d'utiliser le glucose et le CO2 comme co-substrats. Si la glycolyse, le GATHCYC et les cycles TCA partiels sont utilisés simultanément, l'équilibre redox peut être atteint théoriquement, avec 1 mole de SA fixant 0,5 mole de CO2. Cependant, 1 mole de SA nécessite la consommation de 0,33 mole d'ATP au coût de l'ATP régénéré, par exemple par la respiration d'une partie du glucose.
Fig. 3 Production redox-neutre d'acide butanedioïque par une combinaison de glycolyse, GATHCYC, cycle TCA partiel et voie du glyoxylate Tableau 1 Comparaison des voies naturelles et artificielles pour la synthèse de l'AS par la levure

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