Die Kohlenstoffeffizienz ist einer der wichtigsten Faktoren, die die Lebensfähigkeit eines Stoffwechselprozesses bestimmen, und ist die Hauptdeterminante für die Produktrate pro Substrateinheit. Zwei Faktoren bestimmen die Kohlenstoffeffizienz: die Elektronenbilanz vom Substrat zum Produkt, die sich aus dem Grad der Reduktion von Substrat und Produkt berechnen lässt, und die Tatsache, dass die bestehenden Stoffwechselwege in erster Linie auf höhere Reaktionsgeschwindigkeiten und nicht auf hohe Kohlenstoffausbeuten ausgelegt sind. Der erste Faktor hängt eng mit der chemischen Zusammensetzung des Substrats und des Produkts zusammen. Der zweite Faktor kann durch eine Umgestaltung des Stoffwechselwegs überwunden werden, die es ermöglicht, den Kohlenstoff des Substrats während der Produktbildung beizubehalten oder, in einigen Fällen, zu assimilieren.
1. Redox-Gleichgewicht in Hefe Stoffwechsel Die Effizienz von Stoffwechselwegen, die für eine effiziente biologische Produktion von Chemikalien erforderlich sind, hängt von einer Vielzahl von Faktoren ab, wie z. B. Redoxgleichgewicht, Energiebilanz, thermodynamische Machbarkeit, stöchiometrisches Gleichgewicht, Flusskopplung, Rückkopplungshemmung, Produkttoxizität, Kinetik usw. Der zelluläre Stoffwechsel hält das Zellwachstum und das Redox-Gleichgewicht aufrecht, indem er Elektronen von Substraten auf verschiedene Metaboliten überträgt. Daher sollte der optimale Biosyntheseweg für die Produktion eines gewünschten Metaboliten redoxneutral sein und die Ausbeute (YP) des Weges sollte der maximalen theoretischen Ausbeute (YE) der Substrat-Zielprodukt-Kombination entsprechen oder ihr sehr nahe kommen.Die YP hängt von dem betreffenden Stoffwechselweg ab und wird auf der Grundlage seiner Stöchiometrie bestimmt, während die YE die maximale Produktmenge ist, die aus dem Substrat gebildet werden kann, und aus dem Verhältnis von Substrat zu Produkt γS/γP berechnet werden kann, wobei γS und γP der Reduktionsgrad des Substrats bzw. des Produkts sind. Der Reduktionsgrad kann definiert werden als die Anzahl der verfügbaren Elektronenäquivalente pro Kohlenstoffatom der Verbindung. Daher muss YE die Elektronenbilanz für die Umwandlung eines Substrats in ein Produkt berücksichtigen, was eine Decarboxylierung, die zu Kohlenstoffverlusten führt, oder eine Carboxylierung zur zusätzlichen Aufnahme von Kohlenstoff erfordern kann. In der folgenden Abbildung ist der zentrale Stoffwechselweg der Hefe dargestellt. Abbildung 1: Der zentrale Kohlenstoff-Stoffwechselweg der Hefe, der die Beziehung zwischen den Carboxylierungs-/Decarboxylierungsschritten und den Veränderungen im Grad der Substrat- und Produktreduktion verdeutlicht. Der Grad der Reduktion der entsprechenden Substrate, Intermediärmetaboliten und Produkte wird durch den Farbwechsel von rot (γ=0) über gelb (γ=4) zu blau (γ=6) angezeigt
Je nach Reduktionsgrad von Substrat und Zielprodukt lassen sich drei Fälle unterscheiden: Wenn Substrat und Zielprodukt den gleichen Reduktionsgrad haben, wird im Idealfall das Substrat vollständig in das Produkt umgewandelt. Das heißt, die tatsächliche Produktausbeute kann nahe an der maximalen theoretischen Ausbeute (YE) liegen, aber der Stoffwechselprozess erzeugt Nebenprodukte für die Bildung von Biomasse und die Aufrechterhaltung des Zellwachstums, wodurch die Produktausbeute verringert wird. Ein Beispiel ist Milchsäure (γ = 4,0), die den gleichen Reduktionsgrad wie Glukose (γ = 4,0) aufweist. Daher ist der Prozess der Laktatproduktion ein redoxneutraler Weg mit einer ausgeglichenen Stöchiometrie, der gleichzeitig die Erzeugung von ATP ermöglicht, was zu einer Rate nahe der maximalen theoretischen Ausbeute führt. Bei anderen Substrat-Produkten sind solche Wege, die keine übermäßige Reduktionskraft erzeugen, insgesamt selten.
Wenn das Produkt stärker reduziert ist als das Substrat, erzeugen die zur Bildung des Produkts erforderlichen Oxidationsreaktionen zusätzliche oxidative Äquivalente (NAD+, NADP+, FADH+). Um diese oxidativen Äquivalente zu reduzieren, muss die Zelle Kohlenstoff zu CO2 und/oder anderen Nebenprodukten oxidieren (z. B. im Pentosephosphatweg (PPP), im TCA-Zyklus oder im Xylulosephosphatzyklus (XuMP)), um die Redox-Homöostase aufrechtzuerhalten. Dieser Prozess kann die Gesamteffizienz der Substratumwandlung in Zielprodukte beeinflussen. Beispiele hierfür sind Fettsäuren, Ethanol und Glycerin.
Die Verwendung von Glukose als Substrat zur Erzeugung von Fettsäuren, wie z. B. Palmitinsäure (γ = 5,75), verringert die Fettsäureausbeute aufgrund des hohen NADPH-Bedarfs und der Freisetzung von CO2 während der Verlängerung der Kohlenstoffkette, was zu Substratverlusten führt. Yu et al. [1] gelang es, die Fettsäureausbeute in Saccharomyces cerevisiae auf bis zu 40% zu erhöhen, indem sie einen anabolen reduktiven Stoffwechselweg konstruierten, der durch einen sich wiederholenden Decarboxylierungszyklus gekennzeichnet ist, um die Zelle mit zusätzlichem NADH, NADPH und ATP zu versorgen.
Bei der Herstellung von Ethanol aus Glukose werden auch einige Substrate zu CO2 und Glycerin oxidiert, da NADH zugeführt werden muss. Der natürliche Hefeweg für die Gärung von Ethanol behält jedoch den Reduktionsgrad von Glukose (γ = 4,0) bei, mit einer durchschnittlichen Gesamtreduktion von γ = 4,0, wenn CO2 und Ethanol die Endprodukte sind, so dass der Stoffwechselweg aus Sicht des Ertrags sehr effizient ist und nur 4-5% der Kohlenstoffquelle in Glycerin umwandelt. Auch bei der Herstellung von 1,2-Propandiol (1,2-PDO) (γ=5,33) durch Bierhefe unter Verwendung von Glycerin (γ=4,66) als einziger Kohlenstoffquelle wurde durch die metabolische Modifikation zusätzliches NADH bereitgestellt, um die 1,2-PDO-Synthese zu erleichtern, wodurch die bisher höchsten Erträge in Hefe von >4 g/L 1,2-PDO erzielt wurden.
Wenn das Produkt unter das Substrat reduziert wird, entstehen bei der Herstellung des Produkts sowohl reduzierende Äquivalente als auch das Produkt. Ein üblicher Mechanismus zur Reoxidation überschüssiger Reduktionsäquivalente ist die Oxidation durch die Atmungskette, wobei überschüssiges ATP erzeugt und/oder Wärme freigesetzt wird. Infolgedessen liegt die Produktausbeute unter dem theoretischen Maximum, das mit den verfügbaren Elektronen erreicht werden kann. Alternativ können die überschüssigen Reduktionsäquivalente verbraucht werden, indem ein Teil der Kohlenstoffquelle zu reduzierenden Nebenprodukten reduziert wird. Diese Substrat-Produkt-Kombination hat das Potenzial, Kohlenstoff zu fixieren, um die Ausbeute des Zielmetaboliten zu erhöhen. Wie bei der Herstellung von Zitronensäure (γ = 3,0) aus Glukose bedeutet der Energieverlust durch die Bildung von NADH, dass die Zelle durch die Herstellung der Zielverbindung einfach Energie gewinnen kann, allerdings auf Kosten eines Ertragsverlustes. Die geringe Effizienz des natürlichen biochemischen Weges für die Synthese von Zitronensäure stellt daher eine Möglichkeit dar, nahe an die maximale theoretische Gewinnrate heranzukommen, die durch die Fixierung von Kohlenstoff erreicht werden kann.
Daher können die Substrate für die Verwendung im gewünschten Produkt auf der Grundlage von γS und γP ausgewählt werden, um die Ausbeute zu maximieren. Das bevorzugte Substrat der Hefe, Glukose, kann zur Synthese von Produkten mit demselben γ-Wert wie Glukose verwendet werden, z. B. Ethanol (plus CO2) oder Milchsäure. Obwohl Glukose das bevorzugte Substrat ist, steht Glukose in direkter Konkurrenz zur Lebens- oder Futtermittelproduktion. Daher werden mehrere billigere Kohlenstoffquellen wie Glycerin, Methanol und CO2 als vielversprechende Substrate angesehen.
Methanol (γ = 6,0) ist ein C1-Rohstoff mit einem hohen Reduktionsgrad. Einer der Hauptvorteile der Verwendung von Methanol als Kohlenstoffquelle ist sein Reduktionsvermögen, das in Mikroorganismen wie der methylotrophen Hefe NADH bildet und ATP erzeugt. Da jedoch die erste Reaktion des Stoffwechsels die Oxidation von Methanol zu Formaldehyd unter Verwendung von Sauerstoff als Elektronenakzeptor ist, verliert die Hefe ein NADH für jede aufgenommene Portion Methanol.Kürzlich durchgeführte Studien haben gezeigt, dass Komagataella phaffii in der Lage war, Methanol effizienter zu verwerten, indem die endogene Methanol-Dehydrogenase (Adh2) in einem Stamm mit Alkohol-Oxidase-Defizit (Mut-) überexprimiert wurde, was zur Produktion von zusätzlichem NADH und ATP pro Portion Methanol führte, was es dem Mut-Adh2-Stamm ermöglichte, die Intensität der Produktion heterologer Proteine unter Bedingungen mit geringem Sauerstoffverbrauch und geringer Wärmeabgabe zu steigern.
Eine weitere vielversprechende Kohlenstoffquelle ist CO2, eine stark oxidierte Verbindung (γ=0), die von Autotrophen reduziert werden kann, um organische Verbindungen für die Biosynthese herzustellen. Eine Möglichkeit, CO2 in den Hefestoffwechsel einzubringen, ist daher die Co-Substrat-Konversion, bei der CO2 zusammen mit einer anderen Kohlenstoffquelle in ein Produkt mit einem niedrigeren Reduktionsgrad als das Co-Substrat umgewandelt wird. Bei der Biosynthese von organischen Säuren, die einen niedrigeren γ-Wert als Glukose haben, wie Zitronen-, Malein- und Bernsteinsäure, ermöglicht diese Strategie die Einbindung von CO2 in industrielle Fermentationsprozesse, um die Kohlenstoffausbeute zu erhöhen.
2. Wie kann der Grad der Produktreduktion ausgeglichen werden? Die Entwicklung von Stoffwechselprozessen in Mikroorganismen beruht in der Regel auf einem schnellen Wachstum der Zellen und nicht auf der Herstellung bestimmter Produkte. Daher zieht die Zelle einen schnellen Stoffwechsel einer hohen Kohlenstoffausbeute vor. Daher ist die Fähigkeit der Zellen, die Kohlenstoffspeicherung während des Stoffwechsels zu verbessern, eine der größten Herausforderungen im Metabolic Engineering, die mikrobielle Fabriken daran hindert, eine chemische Produktion mit hoher Ausbeute zu erreichen. In diesem Beitrag wird das Metabolic Engineering von Hefe erörtert, das darauf abzielt, die Kohlenstoffspeicherung, einschließlich der CO2-Fixierung, zu maximieren und unwesentliche Decarboxylierungsschritte in der Zelle zu vermeiden.2.1 Integration von anorganischem Kohlenstoff in den zellulären Stoffwechsel unter Verwendung von CO2 als Substrat Es gibt verschiedene Wege: Ein CO2-Molekül bildet durch Carboxylierung organische Verbindungen; CO2 wird durch Reduktion zu Ameisensäure oder CO umgewandelt, die in Biomasse assimiliert werden können. Carboxylierungsreaktionen werden durch Carboxylasen katalysiert, wie RuBisCO im CBB-Zyklus des autotrophen CO2-Fixierungsweges oder die Weg-Enzyme Pck und Pyc, die an der Bereitstellung zentraler Stoffwechselvorstufen beteiligt sind.2 Das Prinzip der Kohlenstoffreduktion besteht darin, dass CO2 durch Ameisensäure-Dehydrogenase oder CO-Dehydrogenase zu Ameisensäure oder CO reduziert wird, wie im reduzierten Acetyl-Coenzym-A-Weg.2.1.1 Expression heterologer CBBase-Enzyme zur CO2-Fixierung in HefeEthanolproduktion in S. cerevisiae Bei der Ethanolproduktion in S. cerevisiae nutzten Guadalupe-Medina et al [2] CO2 als Elektronenakzeptor, um überschüssige Reduktionskraft nutzbar zu machen, d.h., Guadalupe-Medina et al. [2] nutzten CO2 als Elektronenakzeptor, um überschüssige Reduktionskraft zu nutzen, d.h. die Umwandlung von CO2 in das PPP-Stoffwechselintermediat Ru5P durch die CBB-Zyklus-Stoffwechselenzyme RuBisCO und Prk, was zu einem Anstieg der Ethanolproduktion um 10% und einem Rückgang der Produktion von Glycerin als Nebenprodukt um 90% führte.Xia et al. [3] fanden ein Redox-Ungleichgewicht während der anaeroben Fermentation, wenn Xylose als Substrat für die Ethanolproduktion verwendet wurde. Die Expression von RrRuBisCO und SoPRK ermöglichte die Wiederverwendung von CO2 aus der Pyruvat-Decarboxylierung und verringerte die Ausbeute an den Nebenprodukten Xylit und Glycerin.Gassler et al. [4] konstruierten einen funktionellen CBB-Zyklus in der methylotrophen Hefe K. phaffii, der Energie und Reduktionskraft über Methanol liefert und Milchsäure und Malonat unter Verwendung von CO2 als Kohlenstoffquelle produziert.2.1.2 Reduktions-Glycin-Weg
Der reduktive Glycinweg gilt als der effizienteste Weg für aerobes Wachstum unter Verwendung von Ameisensäure. Alle Enzyme des Pro-Glycinwegs sind in S. cerevisiae vorhanden, aber es kann Ameisensäure nicht als Substrat für das Wachstum verwenden. Die Überexpression der endogenen Enzyme des Weges führte zu einer funktionellen Expression des reduzierten Glycinweges, der die Synthese von Glycin aus Ameisensäure und CO2 als Co-Substrat ermöglicht, um das Wachstum von Stämmen mit Glycinmangel aufrechtzuerhalten. Dieser Stoffwechselweg ist auf hohe CO2-Konzentrationen angewiesen (10%). Kürzlich wurde in K. phaffii ein natürlicher sauerstoffresistenter reduzierter Glycinweg identifiziert, dessen natürliche Aktivität jedoch nicht ausreicht, um das Zellwachstum zu unterstützen.
2.1.3 Reduzierter Zweig des TCA-Zyklus (rTCA)
Der reduzierte TCA-Zyklus (rTCA) ist ein CO2-Fixierungsweg, der in Prokaryonten vorkommt. rTCA ist der umgekehrte Prozess des oxidierten TCA-Zyklus und bildet ein Acetyl-Coenzym-A-Molekül durch Fixierung von zwei CO2-Molekülen. Bisher ist der vollständige umgekehrte TCA-Zyklus in Hefe nicht realisiert worden. Ein teilweiser rTCA wurde in Saccharomyces cerevisiae realisiert, um Bernsteinsäure und Äpfelsäure zu produzieren. Yan et al. [5] überexprimierten die Gene, die für die ersten drei Enzyme des Pyc2- und rTCA-Zyklus, Mdh3R, EcFumC und FrdS1, kodieren, in Pdc- und Fum1-defizienten Stämmen, was zu einer Ausbeute an Bernsteinsäure von bis zu 13 g/L mit einer Ausbeute von 0.21 mol/mol. malubhoy et al [ 5] synthetisierten 35 g/L Butandisäure mit einer Ausbeute von 0,63 mol/mol Glycerin über den rTCA-Zyklusweg, wobei der Prozess auch eine Netto-CO2-Fixierung erreichte.
2.2 Vermeidung von unnötiger Decarboxylierung
Biologische Decarboxylierung findet vor allem in katabolen Stoffwechselwegen wie der Glykolyse, dem PPP und dem TCA-Zyklus statt, wo die Reaktion CO2 freisetzt und oft mit einer Oxidation zur Regeneration von NADH und NADPH verbunden ist. Decarboxylierung findet auch in Endprodukt-Vorläufer-Stoffwechselwegen statt, wo alle Decarboxylierungsreaktionen in dem Weg die Kohlenstoffausbeute vom Substrat zum Produkt verringern. Beispielsweise führt Acetylcoenzym A, ein Metabolit, der durch die Decarboxylierungsreaktion von Pyruvat entsteht, zu einem 33%-Verlust von Kohlenstoff in Form von CO2, wodurch die theoretische Produktausbeute jedes Prozesses, der Acetylcoenzym A als Vorläufer enthält, verringert wird. Dazu gehören der TCA-Zyklus sowie die Fettsäure- und Aminosäurebiosynthese. Um den Kohlenstoffverlust bei der Acetyl-Coenzym-A-Synthese zu vermeiden, haben Forscher den unnötigen Decarboxylierungsschritt vermieden, indem sie neue Kohlenstoffspeicherungswege entwickelt haben. Hellgren et al. [6] konstruierten einen zyklischen Kohlenstoffspeicherungsweg (GATHCYC), der auf dem nicht-oxidativen Glykolyse-Weg (NOG) basiert und drei Moleküle Acetyl-Coenzym A aus einem Molekül Fructose-6-Phosphat (F6P) erzeugt, wobei der Weg keinen Kohlenstoff verliert. Die Verwendung dieses Weges führte zu einem Anstieg der 3-Hydroxypropionsäure-Produktion um 109%. Die Einführung des GATHCYC-Stoffwechsels in einen n-Butanol produzierenden Stamm führte zu einer Steigerung der n-Butanolproduktion auf 1,75 g/L und zu einer Verringerung der CO2-Emissionen um 35,2%.
3. Beispiel für die Herstellung von Bernsteinsäure
Neben dem Redox-Gleichgewicht und der Kohlenstoffbindung sind die thermodynamische Machbarkeit und die Energiebilanz Schlüsselfaktoren für die Gestaltung optimaler Stoffwechselwege. Die thermodynamische Machbarkeit bezieht sich auf die Änderung der freien Gibbs-Energie (ΔrG'm) unter physiologisch relevanten Standardbedingungen und bestimmt, ob ein Stoffwechselweg machbar ist oder nicht. Die zelluläre Energie sollte auch ausgeglichen sein, um mehr von der Zielverbindung zu produzieren, da energieaufwendige Produkte zu einem Verlust von Substratkohlenstoff führen, um den Energiebedarf zu decken, während oxidierte Produkte zu einem Energieüberschuss und möglicherweise zu Wärmeabgabe führen. Bernsteinsäure (SA) ist ein Zwischenmetabolit des TCA-Zyklus. In diesem Abschnitt werden verschiedene Strategien zur Herstellung von SA untersucht und die ATP-Stöchiometrie, das Redox-Gleichgewicht, die CO2-Fixierung, die thermodynamische Machbarkeit und die Kohlenstofferhaltung für verschiedene natürliche und künstliche SA-Synthesewege bewertet. Es gibt drei Synthesewege für Bernsteinsäure: den oxidativen TCA-Zyklus (oTCA), den reduzierten TCA-Zyklus (rTCA) und den Glyoxalatweg (GS). Der oTCA-Zyklus hat eine geringere theoretische Maximalausbeute, aber die Produktion von Bernsteinsäure unter aeroben Bedingungen hat den Vorteil, dass nur wenige Nebenprodukte anfallen und die thermodynamischen Stoffwechseleigenschaften günstiger sind. gS ist eine alternative Methode zur Herstellung von Bernsteinsäure, bei der die beiden Decarboxylierungsschritte zwischen Isocitronensäure und Butandiyl-Coenzym A umgangen werden, um Kohlenstoffverluste zu vermeiden und zusätzliches NADH bereitzustellen. rTCA fixiert CO2 und ist doppelt so effizient wie der oTCA-Weg. Es ist wichtig zu beachten, dass die Ausbeuterate (YP) ein lokaler Parameter ist, der nur die Nettostöchiometrie im Stoffwechselweg berücksichtigt und den Kohlenstoffverlust während der NAD(P)H-Regeneration oder der ATP-Erzeugung nicht mit einbezieht. Die maximale theoretische Ausbeute (YE) ist jedoch ein globaler Parameter, der die Elektronenbilanz und damit auch die Regeneration von NAD(P)H berücksichtigt. Daher kann YP in manchen Fällen höher sein als YE. Die rTCA-Zyklus-Synthese von SA wird hauptsächlich von Pansenbakterien unter anaeroben Bedingungen durchgeführt. Im Gegensatz dazu ist der rTCA-Zyklus für Hefe thermodynamisch ungünstig und führt zu einer unzureichenden Versorgung mit zellulärem NADH. In der folgenden Abbildung wird die Änderung der freien Gibbs-Energie der SA-Synthese über den oTCA-Zyklus oder den rTCA-Zyklus mit verschiedenen Kohlenstoffquellen verglichen. Dazu gehören Glucose, Glycerin, Xylose über den partiellen CBB-Zyklus, Assimilation von Ameisensäure oder Methanol über den reduzierten Glycinweg und Assimilation von Methanol über den Xyloglucanphosphatweg. Abbildung 2. Herstellung von Bernsteinsäure über den oxidativen oder reduktiven Zweig des TCA-Zyklus
Die Fähigkeit der Hefe, einen niedrigeren pH-Wert zu tolerieren und damit die Kosten der SA-Produktion während der nachgeschalteten Verarbeitung zu senken, hat dazu geführt, dass die SA-Produktion durch Hefe große Aufmerksamkeit erregt hat, insbesondere der rTCA-Zyklus, der in der Lage ist, CO2 zu fixieren. Obwohl die Synthese von SA aus Glukose über die Glykolyse und den rTCA-Zyklusweg 1 mol CO2/mol SA fixieren kann, ist der Weg nicht redox-balanciert und erfordert zusätzlich 1 mol NADH für jedes 1 mol produziertes SA. Eine attraktive Alternative ist die Verwendung von Glycerin als Kohlenstoffquelle, das 1 mol CO2/mol SA über den rTCA-Weg fixieren kann und eine oxidativ-reduktions-balancierte SA-Produktion ermöglicht. Die Gesamtreduktion γ = 3,5 für die Kombination von Glycerin + CO2 ist die gleiche wie die von SA. Malubhoy et al. [5] erzielten durch die Fixierung von CO2 einen Ertrag von 0,6 g/g Glycerin, was 47,1% des theoretischen Maximums entspricht.
Eine andere Möglichkeit, ein Redox-Gleichgewicht zu erreichen, besteht darin, Glukose und CO2 als Co-Substrate zu verwenden. Wenn Glykolyse, GATHCYC und partielle TCA-Zyklen gleichzeitig genutzt werden, kann theoretisch ein Redox-Gleichgewicht erreicht werden, bei dem 1 mol SA 0,5 mol CO2 bindet. 1 mol SA erfordert jedoch den Verbrauch von 0,33 mol ATP auf Kosten von regeneriertem ATP, z. B. durch Veratmung eines Teils der Glukose. Daher muss dieses Szenario unter zumindest leicht aeroben Bedingungen durchgeführt werden, was einen weiteren Kostenfaktor des Prozesses darstellt.
Abb. 3 Redoxneutrale Produktion von Butandisäure durch eine Kombination aus Glykolyse, GATHCYC, partiellem TCA-Zyklus und dem Glyoxylatweg Tabelle 1 Vergleich natürlicher und künstlicher Synthesewege für SA in Hefe
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